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一、 研究背景与核心问题
CRISPR-Cas系统已成为基因组编辑的强大工具。除了广泛使用的Cas9和Cas12a，Type V-I 系统的Cas12i亚家族因其蛋白尺寸较小而备受关注。然而，许多天然的Cas12i核酸酶在人类细胞中的编辑效率较低，限制了其应用。本研究的目标是优化一个未被充分表征的Cas12i成员——Cas12i3，提升其活性、拓宽其PAM识别范围，并降低其脱靶效应，从而创建一个强大的通用型编辑平台。
二、 核心策略：AI引导的理性设计与蛋白质工程
研究团队采用了多步骤的工程化策略来优化Cas12i3：
AI结构预测与理性设计：
首先，利用 AlphaFold2预测了Cas12i3的三维结构，并将其与已解析的Cas12i2结构进行比对，确认了二者具有高度的结构相似性。
基于结构信息，研究人员预测了Cas12i3中与crRNA及目标DNA相互作用的关键残基。
深度突变扫描筛选关键突变：
为了增强这些关键残基与带负电的核酸之间的静电相互作用，研究团队构建了一个包含 150多个单点突变（均突变为带正电荷的精氨酸，Arg/R）的Cas12i3变体库。
通过在CHO细胞中使用报告系统进行高通量筛选，从库中鉴定出了 8个能显著提升Cas12i3编辑活性的单点突变：S7R, N168R, D233R, T235R, D267R, T505R, S599R, D851R。
组合优化与高性能变体诞生：
随后，研究人员将上述有效突变进行组合，首先在功能区域（PAM相互作用区、底物DNA相互作用区）内进行组合测试，然后再进行跨区域组合。
最终，获得了包含 五个关键突变（S7R, D233R, D267R, N369R, S433R）的最优组合，并将其命名为 Cas-SF01。
三、 关键发现与成果
1. 卓越的编辑效率
远超野生型：Cas-SF01在哺乳动物细胞中的编辑效率比野生型Cas12i3提高了约3倍。
媲美主流工具：在与当前最先进的编辑工具（如SpCas9, AsCas12a Ultra, hfCas12Max）的直接对比中，Cas-SF01表现出可比甚至更优的编辑效率，在不同内源基因位点的平均插入/缺失（indel）效率高达~80%。
2. 拓宽的PAM识别范围
天然Cas12i3主要识别 TTN PAM。
Cas-SF01不仅保持了高效的TTN PAM识别能力，还显著增强了对非经典PAM（如 NATN和 TTVN）的识别，极大地扩展了其基因组靶向范围。
3. 高特异性与高保真变体
Cas-SF01本身已表现出较低的脱靶效应。通过GUIDE-seq分析证实，其在全基因组范围内具有很高的特异性。
为进一步提升特异性，研究团队通过额外的深度突变扫描，发现了一个关键突变 D876R。将该突变引入Cas-SF01，创造了 高保真版本Cas-SF01HiFi。该变体在几乎不损失靶向编辑效率的前提下，显著降低了对错配向导RNA的耐受性，即大幅减少了脱靶编辑。
4. 在动物和植物中的高效体内编辑
研究证明了Cas-SF01在活体应用中的巨大潜力：
小鼠体内：通过脂质纳米颗粒（LNP）递送Cas-SF01的mRNA和化学合成的crRNA到小鼠肝脏，成功编辑了Ttr基因，诱导了高达34%的indel效率，并显著降低了血清中TTR蛋白水平，效果与SpCas9相当。
植物中：通过农杆菌介导的转化，Cas-SF01在水稻、辣椒和大豆中均表现出强大的编辑能力。
在水稻中，其编辑效率（77.2%）远超野生型Cas12i3（15.5%），甚至达到Cas9的两倍。
在辣椒和大豆中，Cas-SF01能有效编辑多个靶基因，而野生型Cas12i3几乎检测不到活性。
四、 总结与意义
这项研究成功地：
发现并深度优化了一个新型的基因组编辑工具 Cas-SF01。
证实了 “AI结构预测 + 深度突变扫描 + 组合优化”这一蛋白质工程策略在开发高效生物工具方面的强大效力。
证明了Cas-SF01是一个高效、高特异性、PAM范围宽泛的编辑器。
展示了Cas-SF01在多物种（从动物到植物）中均具有卓越的体内编辑能力，为生物医学研究和农业育种提供了一个极具前景的新平台。
总之，Cas-SF01的诞生不仅丰富了基因组编辑工具箱，更展示了通过理性蛋白质工程将天然低效元件转化为强大应用工具的可行性与巨大潜力。这项工作为未来开发更多新型、高效的CRISPR系统提供了宝贵的范式。
