一、 研究背景与核心目标

传统的生物催化剂（如天然酶）通常通过改造和优化现有天然蛋白而来。从头蛋白质设计提供了一种截然不同的途径：从零开始，根据物理原理和预定功能，设计和构建全新的蛋白质。这种方法不仅能验证我们对蛋白质结构与功能关系的理解，更能创造出具有天然蛋白质所不具备的理想特性的催化剂。

本研究旨在设计一类全新的、名为 NovoChromes的蛋白质，其核心目标是整合以下诸多理想特性，这些特性是许多天然酶难以同时具备的：

• 小尺寸（<13 kDa）：提高催化剂的摩尔效率（每克催化剂的活性更高）。

  
  

• 高热稳定性：可在高达100°C的温度下使用。

  
  

• 兼容非天然辅因子：能够嵌入合成卟啉等多种有机金属辅因子。

  
  

• 有机溶剂耐受性：在绿色有机溶剂（如乙醇）中保持稳定和活性，以增强底物溶解度和调控反应性。

  
  

• 适用于高底物浓度：在0.1至2.0 M的高浓度下有效工作，无需构建深度的底物结合口袋。

  
  

• 可进化性：能够在大肠杆菌等完整细胞中进行定向进化（Directed Evolution, DE）以进一步优化性能。

  
  

二、 核心研究策略与设计流程

研究团队选择了两个具有挑战性的非天然反应来验证其设计策略：

1. 环丙烷化反应（Cyclopropanation）：涉及两个C-C键的立体选择性形成。

   
   

2. 硅-氢插入反应（Si-H insertion）：涉及卡宾对Si-H键的插入。

   
   

其核心设计流程结合了计算设计和定向进化：

1. 初始设计：

   
   

• 以一个先前设计的卟啉结合蛋白（MPP1）为起点。

  
  

• 通过截断部分C端螺旋（为底物和过渡态腾出空间）和可变骨架序列设计，生成了一系列候选蛋白序列。

  
  

• 使用LigandMPNN等工具进行序列设计，确保蛋白能容纳所需的过渡态（如(S,S)-构型），同时排斥不需要的异构体。

  
  

2. 迭代优化与结构分析：

   
   

• 对表达纯化后的蛋白进行活性测试，筛选出高活性和高选择性的变体（如PNC1）。

  
  

• 通过晶体结构解析发现初始设计的活性位点细节与模型有偏差，指导了下一轮设计。

  
  

• 使用MASTER等骨架搜索算法寻找更优的骨架构象，重新设计出性能更卓越的变体，如PNC2。

  
  

3. 定向进化（针对Si-H插入反应）：

   
   

• 为了实现在完整细胞中的生物合成和筛选，设计了能紧密结合天然血红素（heme）的变体（如FeHP-1）。

  
  

• 在大肠杆菌细胞内进行多轮定点饱和突变和筛选，进一步优化活性与选择性，最终获得进化后的变体（如 FeHP-1*: A70P/F106V/N112S）。

  
  

三、 关键研究成果

1. 卓越的催化性能：

   
   

• 环丙烷化：设计出的蛋白PNC2催化苯乙烯与重氮乙酸乙酯的环丙烷化反应，表现出极高的立体选择性（对映体比率 e.r. > 99.8:0.2，非对映体比率 d.r. 98.5:1.5），转换频率（TOF）高达 290,000 h⁻¹，总转换数（TTN）达 40,000。

  
  

• 硅-氢插入：进化后的蛋白 FeHP-1*催化Si-H插入反应，TTN达到 32,990，e.r. > 99:1，在50%甲醇中的TOF高达 260,000 h⁻¹，比之前报道的进化天然蛋白快95倍。

  
  

2. 非凡的稳定性与溶剂耐受性：

   
   

• 设计的蛋白质具有极高的热稳定性（熔解温度 Tm > 90°C）。

  
  

• 在高达70%的乙醇中仍能保持其天然结构和催化活性（产率99%，e.r. >99:1），这一特性远超大多数在>10-20%有机溶剂中就会失活的天然蛋白质。

  
  

3. 广泛的底物范围：

   
   

• PNC2和FeHP-1*能高效催化多种带有不同取代基（甲基、氟、氯、三氟甲基、甲氧基、酯基、氨基、酚羟基等）的底物，均保持了高活性和高立体选择性。

  
  

4. 机理与进化洞察：

   
   

• 分子动力学（MD）模拟揭示，随着定向进化的进行，蛋白质的构象集合体逐渐收窄，活性位点变得更加刚性化和预组织化，从而更有利于底物以特定方向接近，实现极高的立体选择性。

  
  

• 进化过程中出现的一个关键突变是 A70P（丙氨酸→脯氨酸）。尽管脯氨酸是螺旋结构的破坏者，但这一突变却通过诱导局部构象变化，更好地匹配了底物的轮廓，提高了活性。这显示了计算设计与定向进化的高度互补性——有些有益突变难以通过理性设计预先预测。

  
  

四、 研究意义与结论

这项研究成功地证明了从头设计能够创造出兼具多种理想特性的高效生物催化剂。

• 方法论突破：它将计算蛋白质设计与定向进化完美结合，展示了从“初版设计”到“优化升级”的完整蛋白质工程流程。

  
  

• 性能标杆：NovoChromes系列蛋白在尺寸、稳定性、溶剂耐受性、活性和选择性方面设定了新的标准，展现了超越许多天然酶和工程化天然酶的潜力。

  
  

• 应用前景：这类可编程、高效、且稳定的催化剂为绿色化学合成和生物制造提供了强大的新工具，有望应用于众多工业相关的化学转化过程。

  
  

• 科学启示：它揭示了通过控制蛋白质的构象动力学和预组织化是实现高效催化的关键，深化了我们对酶催化原理的理解。

  
  

总结而言，这项工作不仅是蛋白质设计领域的一项技术成就，更开辟了创造定制化生物催化剂的新范式，为合成化学和生物技术带来了广阔的未来。