一、 研究背景与核心问题

基因编辑技术（如CRISPR-Cas）在研究和治疗遗传疾病方面潜力巨大，但其临床应用面临一个关键瓶颈：递送问题。最有效的编辑器（如SpCas9）体积过大，无法装入常用的递送载体（如腺相关病毒AAV）。因此，体积更小的替代品，如 Cas12f和 TnpB家族蛋白，备受关注。

然而，这些小型核酸酶在哺乳动物细胞中的编辑效率通常很低，限制了其应用。传统的蛋白工程方法（如理性设计或在细菌/噬菌体中进行定向进化）存在局限：它们无法完全模拟人类细胞的复杂环境（如染色质结构、DNA修复通路），因此筛选出的变体在人类细胞中可能表现不佳。

本研究旨在解决这一核心问题：直接在人类细胞中，通过定向进化筛选出具有更高同源定向修复（HDR）效率的小型核酸酶变体。

二、 研究方法：哺乳动物细胞定向进化平台

研究团队建立了一个高效的在人类细胞中进行定向进化的流程。

1. HDR荧光报告系统：构建了一个基于EGFP的报道系统。EGFP基因的起始密码子被破坏，只有当核酸酶、向导RNA和提供正确模板的ssODN共同作用，成功完成HDR修复后，细胞才会发出绿色荧光。

   
   

2. 进化流程：

   
   

• 构建突变库：对两种小型核酸酶（基于Un1Cas12f1的工程化版本CasMINI 和 ISDra2 TnpB）进行易错PCR，构建包含数百万个变体的文库。

  
  

• 功能筛选：将突变库导入含有报道基因的HEK293T细胞中，同时提供向导RNA和ssODN。

  
  

• 富集高活性变体：通过流式细胞分选术（FACS）收集发出强绿色荧光的细胞，这些细胞表达了HDR效率更高的核酸酶变体。

  
  

• 迭代进化：从筛选出的细胞中回收核酸酶基因，进行下一轮突变和筛选，共进行了四轮，逐步富集有益突变。

  
  

3. 优势：直接在目标环境（人类细胞）中进行筛选，确保选出的变体能够适应人类细胞的生物学特性，并直接优化了治疗应用中至关重要的HDR效率，而非仅仅是催化活性。

   
   

三、 关键发现：高效变体 Cas12f1Super 和 TnpBSuper

通过上述定向进化流程，研究人员成功获得了活性显著提升的变体。

1. 突变组合的发现与优化：

   
   

• 通过测序分析进化过程中被富集的突变，并系统性地测试了数百个单点突变和组合变体。

  
  

• 最终，为CasMINI筛选出包含5个关键突变（K52E, K129E, E206K, K227E, K506E）的最佳组合，命名为 Cas12f1Super。

  
  

• 为TnpB筛选出包含9个关键突变的最佳组合，并辅以哺乳动物密码子优化和更短的向导RNA（Trim2 wRNA），命名为 TnpBSuper。

  
  

2. 编辑效率的巨大提升：

   
   

• 在报道基因系统中，Cas12f1Super和TnpBSuper的HDR效率相比各自的亲本（CasMINI和TnpB）提升了最高达11倍。

  
  

• 更重要的是，这种高效性在13个不同的内源性基因组位点上得到了验证。Cas12f1Super在所有7个测试位点均表现出显著更高的HDR效率，绝对效率在NLRC4位点最高可达~30%。TnpBSuper在6个位点中的4个也表现出显著提升。

  
  

3. 在多种细胞类型和治疗相关场景中的验证：

   
   

• 原代T细胞：使用mRNA递送TnpBSuper，在三个内源位点观察到HDR效率最高提升6.9倍。

  
  

• 治疗相关靶点：在鼠源肝癌细胞（Hepa 1-6）中靶向治疗高胆固醇血症的潜在靶点 Pcsk9基因时，Cas12f1Super和TnpBSuper也展现出显著更高的基因敲除（NHEJ）效率，绝对效率分别达到51%和43%。

  
  

4. 高特异性（低脱靶效应）：

   
   

• 使用DISCOVER-Seq技术评估脱靶效应，发现尽管Cas12f1Super和TnpBSuper的靶向活性大幅提高，但它们并未引入新的脱靶切割位点，保持了与亲本相似的高特异性。

  
  

四、 拓展应用：高效的碱基编辑器

为了展示Cas12f1Super的多功能性，研究人员将其催化中心失活后，与腺嘌呤脱氨酶TadA*融合，构建成腺嘌呤碱基编辑器（ABE）。

• 在测试的四个位点上，基于Cas12f1Super的碱基编辑器（dCas12f1Super-ABE）的效率均显著高于基于CasMINI的版本（dCasMINI-ABE），提升幅度最高达10倍，在TTR位点的绝对编辑效率达到17%。

  
  

• 编辑窗口与亲本相似，但活性更高，且几乎只产生纯净的A-to-G转换，没有检测到插入缺失（indels），展示了其作为精准治疗工具的潜力。

  
  

五、 研究意义与结论

这项研究成功地证明了在哺乳动物细胞中进行定向进化是优化基因编辑工具的强有力策略。

• 技术创新：建立的哺乳细胞定向进化平台能够直接筛选出在复杂生理环境下性能更优的变体，克服了传统方法的局限性。

  
  

• 工具突破：获得的 Cas12f1Super和 TnpBSuper是迄今为止最高效的小型基因编辑器之一，它们兼具小尺寸、高效率和高特异性，极大增强了其通过AAV等载体进行体内基因治疗的可行性。

  
  

• 应用前景：这些超活性编辑器不仅可用于基础研究，更在基因治疗、细胞疗法（如CAR-T）等领域展现出巨大的临床应用潜力，为治疗遗传性疾病提供了新的强大工具。

  
  

总之，这项工作通过巧妙的实验设计，将定向进化的力量直接应用于最终的应用场景，为下一代基因编辑工具的开发树立了标杆。