基因编辑新利器：常温高效工作的CpAgo实现高精度双链DNA切割

中国科学家解析其依赖二聚化与新型PAZ口袋的激活机制，为基因组编辑注入新动能

研究背景与核心问题

Argonaute (Ago) 蛋白是存在于真核生物和原核生物中的关键核酸酶。真核Ago (eAgos) 通过小干扰RNA (siRNA) 或 microRNA (miRNA) 进行RNA干扰的机制已被广泛研究。然而，原核Ago (pAgos) 在细菌防御中的工作机制，特别是在常温（中温）条件下，仍未被充分探索。

此前已知的许多pAgos（如TtAgo）是嗜热的，需要在高温（~65°C）下才能发挥最佳活性，这限制了其在生理相关条件下的研究和应用。虽然近期发现了一些中温pAgos（如CbAgo, LrAgo），但它们的催化效率相对较低。因此，发现并阐明一种在37°C下具有高效活性的中温pAgo的分子机制，对于理解原核免疫和开发新型生物技术工具至关重要。

核心发现：CpAgo的双重催化活性与高效性

本研究聚焦于来自产气荚膜梭菌的CpAgo，并揭示了其独特的催化能力：

1. 不依赖引导链的催化活性 (Guide-independent activity)：

   CpAgo在没有引导DNA (gDNA)的情况下，能高效地将质粒DNA和结构化的RNA（如SL5 RNA）降解成小片段。对于质粒DNA，它能在30分钟内将其完全降解为约21个核苷酸的产物。这种活性不依赖于PIWI结构域中经典的DEDX催化四联体，因为催化失活突变体（D614A）仍保留此功能。

   
   

2. DNA引导的靶向切割活性 (DNA-guided cleavage activity)：

   CpAgo能利用短链单链DNA (ssDNA) 作为引导链，在37°C下特异性切割与引导链互补的单链DNA (ssDNA) 和双链DNA (dsDNA)。对于dsDNA的切割，需要目标区域存在部分解链（如“气泡”结构）。

   
   

与另一种中温pAgo (IbAgo) 相比，CpAgo在上述两种活性上都表现出显著更高的催化效率，使其成为研究pAgo功能的理想模型。

分子机制：结构生物学揭示的全新见解

通过冷冻电镜 (cryo-EM) 技术，研究人员解析了CpAgo与核酸复合物的高分辨率结构，揭示了其独特工作机制的关键要素：

1. PAZ结构域中的新型核苷酸结合口袋：

   在CpAgo的PAZ结构域中发现了一个富含正电荷氨基酸的核苷酸结合口袋。该口袋对于引导链依赖性和非依赖性的底物识别与切割都至关重要。突变该口袋中的关键氨基酸（如K50, R246等）会严重破坏CpAgo的切割活性和底物特异性。

   
   

2. 二聚化是催化活性的先决条件：

   结构分析表明，CpAgo的二聚化是其发挥催化功能所必需的。无论是引导链依赖的靶向切割，还是引导链非依赖的核酸降解，都需要形成二聚体。

   
   

• 活性形式： 与引导链和目标DNA结合后形成的二聚体是催化活性状态。

  
  

• 非活性形式： 仅与引导链结合的单体状态是催化失活的。

  
  

• 激活机制： 目标DNA的结合诱导了从单体到二聚体的构象变化，使PIWI结构域中的催化残基（如D544）精确定位到切割位点，从而激活酶活性。

  
  

3. 引导链非依赖活性的催化中心：

   研究发现，PAZ结构域中的D80和D249是引导链非依赖的核酸降解活性的关键催化残基。这与PIWI结构域中的经典催化中心（DEDX）是分开的，解释了为什么PIWI的催化突变体（D614A）仍能降解质粒。

   
   

生物学功能验证：细菌细胞内的防御作用

研究在大肠杆菌中验证了CpAgo的生物学功能：

• 引导链非依赖的质粒清除： 表达野生型CpAgo能显著降低细菌细胞中外来质粒的保有量，而PAZ口袋关键残基的突变（D80A, D249A）则削弱了这一效应。

  
  

• DNA引导的DNA干扰： 通过双质粒干扰实验证实，CpAgo能在细胞内进行引导DNA依赖的靶向切割，有效干扰目标质粒的存活。

  
  

基于这些发现，研究者提出了一个CpAgo介导的原核防御模型：CpAgo通过其引导链非依赖的活性降解外来核酸（如噬菌体DNA），产生短的DNA片段；这些片段随后可作为引导链，通过引导链依赖的途径进一步靶向和清除入侵的遗传物质。

研究意义与前景

1. 理论意义： 本研究深入揭示了中温pAgo CpAgo的双重催化机制、独特的PAZ口袋功能以及二聚化激活模式，极大地增进了我们对pAgo介导的原核免疫系统的理解。

   
   

2. 技术潜力： CpAgo在37°C下的高效活性，特别是其切割dsDNA的能力，使其成为基因组编辑和分子诊断等领域一个有巨大潜力的新型工具。其引导链非依赖的“非特异性”核酸降解活性也可能在抗菌或抗病毒应用中发挥作用。

   
   

总结： 这项工作系统地表征了CpAgo作为一种高效、多功能的中温pAgo，通过结构生物学和功能实验阐明了其依赖于新型PAZ口袋和二聚化的独特工作机制，不仅深化了基础科学认知，也为未来的生物技术应用开辟了新道路。