近日，上海交通大学的研究团队在《Chemical Engineering Journal》上发表题为“Directed evolution of a miniature Cas12f1 nuclease from Acidibacillus sulfuroxidansfor expanded PAM recognition and enhanced nuclease activity”的研究。他们通过对微型CRISPR-Cas12f1核酸酶进行定向进化，成功开发出一种名为 AsCas12f1-M5 的新型变体。该变体不仅显著拓宽了其识别基因组靶点的能力，还大幅提升了在人类细胞中的编辑效率，为基于腺相关病毒（AAV）递送的体内基因治疗提供了更强大的工具。

一、研究背景：微型CRISPR工具的瓶颈

以Cas9和Cas12a为代表的CRISPR核酸酶已彻底改变了基因编辑领域，但它们通常超过1000个氨基酸的大小，超出了常用递送载体——腺相关病毒（AAV）的有效包装容量，限制了其在基因治疗中的应用。

来源于嗜酸硫化芽孢杆菌的 AsCas12f1 是目前已知最小的、可切割双链DNA的CRISPR核酸酶，其尺寸仅为422个氨基酸，非常适合AAV递送。然而，它的临床应用面临两大主要限制：

1. 严格的PAM限制：野生型AsCas12f1仅识别非常有限的PAM序列（5‘-TTR，其中R为A或G），这使得人类基因组中绝大多数潜在靶点，尤其是许多与疾病相关的位点，都无法被编辑。

2. 在哺乳动物细胞中的编辑活性有限：尽管此前已有研究通过突变提升了其活性，但PAM识别的狭窄范围这一根本性瓶颈仍未解决。

二、核心突破：M5变体的设计与特性

研究团队采用了一种基于结构分析的半理性设计策略。他们首先分析了AsCas12f1与sgRNA、DNA复合物的结构，确定了41个与PAM识别或DNA结合相关的关键残基，并针对这些位点构建了饱和突变文库。

利用一种在大肠杆菌中建立的、基于ccdB毒素基因的生长偶联筛选系统，研究人员成功筛选出了能够识别非经典PAM序列的突变体。通过多轮迭代组合，最终获得了包含五个关键氨基酸替换（G57R/M114Y/M157V/S188R/D311K）的AsCas12f1-M5（简称M5） 变体。

关键特性如下：

1. PAM识别范围大幅扩展：M5不仅能有效识别野生型的经典PAM（5‘-TTA/TTG），还能高效识别六种新的非经典PAM（5’-TTC, TTT, TCA, TCC, TCG, TCT），总计识别 8种不同的5‘-TYN PAM。这使其潜在可靶向的基因组位点数量增加了近三倍。

2. 核酸酶活性显著增强：在人类细胞（HEK293T）中，M5的编辑活性比野生型AsCas12f1最高提升了11.6倍。即使在非经典PAM位点，M5也能实现高效的基因编辑。

三、实验验证：从体外、细胞到活体

• 体外活性验证：体外切割实验表明，M5可高效切割含有多种PAM的DNA底物，而野生型仅能切割经典PAM底物。（可配图：Fig. 3a）

• 细胞内活性验证：在人类细胞中使用eGFP报告系统评估PAM识别。结果显示，M5在多种基因位点（如TP53, PDCD1等）的经典和非经典PAM上均能高效激活eGFP，而野生型和其他已报道的变体（如V5.1, enAsCas12f）在非经典PAM上活性很低。（可配图：Fig. 4b, 4c）

• 活体动物编辑验证：通过AAV8载体将M5递送至小鼠肝脏，靶向Ttr基因。结果显示，M5在经典（5‘-TTG）和非经典（5’-TCA, 5‘-TCC）PAM位点均能实现有效编辑，导致小鼠血清中转甲状腺素蛋白（TTR）水平显著降低最高达30%。这证明了M5在体内的治疗潜力。

  
  

四、应用前景与意义

1. 扩展靶点范围：PAM识别范围的拓宽，使得许多原先因PAM序列限制而“不可成药”的疾病相关基因位点变得可编辑，为治疗更多遗传性疾病提供了可能。

2. 兼容AAV递送：M5保持了AsCas12f1的微型尺寸（422个氨基酸），使其能够轻松包装进AAV载体，实现高效、特异的体内递送。研究已在小鼠模型中成功验证了其通过AAV介导的肝脏编辑和胚胎注射介导的生殖系编辑的有效性。

3. 安全性初探：初步的动物实验表明，AAV递送M5未引起明显的肝脏功能指标（ALT/AST）或系统性炎症因子（IL-6, TNF-α, IL-1β）的持续升高，提示了其良好的安全性。

五、总结

本研究成功开发出的AsCas12f1-M5变体，在保持其超紧凑尺寸优势的同时，突破了原有PAM识别的严格限制，并大幅提升了编辑效率。这项工作为开发下一代微型、高效、靶向范围更广的CRISPR基因治疗工具奠定了坚实的基础，有望推动针对更多遗传疾病的体内基因编辑疗法的发展。

标准引用格式

Li, Z., Deng, Y., Huo, Y. et al.Directed evolution of a miniature Cas12f1 nuclease from Acidibacillus sulfuroxidansfor expanded PAM recognition and enhanced nuclease activity. Chem. Eng. J.537, 176417 (2026).

https://doi.org/10.1016/j.cej.2026.176417