cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-)
-20℃储存，0℃运输。
包装内容
产品编号 | 产品名称 | 包装 |
P2022 | M-MLV Reverse Transcriptase (RNase H-, mutant) | 100μl |
B2021 | 5X M-MLV Reverse Transcription Buffer | 500μl |
K1002 | dNTP (10mM each) | 200μl |
P2058 | RNase Inhibitor | 100μl |
N0001 | Oligo (dT)18 Primer (0.5μg/μl) | 100μl |
N0002 | Random Hexamer Primer (0.2μg/μl) | 100μl |
B50011 | RNase-free H2O | 1.5ml |
产品简介
采用了经过改造和优化的M-MLV反转录酶(RNase H-)，用于以总RNA、mRNA等为模板反转录合成cDNA第一链的试剂盒。本试剂盒包含了第一链合成所需的所有试剂。
合成的第一链，可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR、cDNA的第二链合成以及cDNA文库的构建等。
由于缺失了RNase H酶活性，RNA和DNA双链复合物中的RNA不会被降解，可以轻松完成长度为8 kb及以下基因的反转录。
M-MLV反转录酶(RNase H-)热稳定性高，最适反应温度为42-45ºC，温度达到50ºC时仍具有相当活性。
试剂盒提供Oligo(dT)18和random hexamer两种引物，前者适合用于带有Poly(A)尾的mRNA的反转录，后者进行反转录时不需要poly(A)尾。也可以自行采用基因特异性引物进行cDNA第一链的合成。
使用说明
Component | 20μl reaction | Final Concentration |
Template RNA | Total RNA | 0.1ng-5μg |
mRNA/poly(A) RNA | 0.01-500ng |
specific RNA | 0.1pg-500ng |
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Primer | Oligo(dT)18 | 1μl |
Random Hexamer | 1μl |
Gene-specific | 10-25pmole |
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Nuclease-free water | Up to 13.5µl |
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轻轻混匀后短暂离心，65℃孵育5分钟，立即置于冰上冷却，加入如下组分。 |
5X M-MLV Reverse Transcription Buffer | 4μl | 1X |
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RNase Inhibitor (40U/μl) | 0.5μl | 1U/μl |
dNTP Mix (10mM each) | 1μl | 0.5mM |
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M-MLV Reverse Transcriptase RNase H-, mutant | 1μl | 100U |
轻轻混匀后短暂离心。如果使用Oligo(dT)12-18，40ºC先行孵育10分钟；如果使用随机引物，室温先行孵育10分钟；然后在40-55℃孵育50分钟。如果使用基因特异性引物，在40-55℃一步孵育60分钟即可。
70℃孵育15分钟可以终止反转录反应。
常见问题
1. 建议使用内参基因做对照。
2. RNA模板降解，可以通过琼脂糖凝胶电泳分析总RNA质量。严格遵守RNA操作要求避免发生降解。
3. RNA纯度低，存在抑制反转录反应残余成分，建议使用Trizol或柱纯化。
4. RNA模板量不足，建议更换模板来源或DNase I去除DNA干扰。
5. 对于长片段cDNA反转录不建议使用热失活方法终止反应，可能会导致产物断裂。此时可以考虑酚氯仿抽提或柱纯化方法。
6. 对于复杂模板如高GC含量或二级结构，可以适当提高反应温度至45-50℃。
7. 某些情况可能需要去除cDNA互补RNA，可以加1ul (2U) RNase H在37℃孵育20分钟。
