Theta Probe qPCR Mix (2X)
-20℃避光储存，<0℃避光运输，避免反复冻融。
包装内容
产品编号 | 产品名称 | 包装 |
P30012 | Theta Probe qPCR Mix (2X) | 1/5/25ml |
产品简介
基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR (Quantitative PCR-QPCR或real-time PCR)高品质预混液，用于cDNA和基因组DNA等的特异性超高灵敏度定量检测；特别适用于低丰度或高特异性的目的基因检测，如低丰度mRNA、lncRNA、miRNA、微生物RNA，同源基因或SNP检测。
可用于多重荧光定量PCR检测；
使用耦合的Taq DNA聚合酶，实现便捷高效的热启动聚合反应；
不含ROX，适用于无需ROX校正的荧光定量PCR仪如：
Bio-Rad: CFX384, CFX96, MiniOpticon, iCycler IQ, MyiQ and iQ5；
Eppendorf: Mastercycler ep realplex and realplex2 s；
Qiagen/Corbett Rotor-Gene: 6000；
Roche: LightCycler 480；
Cepheid: SmartCycler；
Illumina: Eco qPCR。
预混液包含所有通用组分，用户只需自备引物、探针、模板DNA和去离子水即可。
使用说明
反应体系：解冻并彻底混匀各组分，于冰浴设置如下反应体系(以96孔板为例)。
Component | 20μl reaction | Final Concentration |
Theta Probe qPCR Mix (2X) | 10μl | 1X |
5µM Forward Primer | 1μl | 0.25µM (0.1~1µM) |
5µM Reverse Primer | 1μl | 0.25µM (0.1~1µM) |
Probe# | 0.5μl |
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Template DNA | Xμl | Genomic DNA | 10–100ng |
cDNA | 1-10ng |
Nuclease-free water | Up to 20µl |
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短暂离心后，将PCR管或板置于荧光定量PCR仪；
设置如下热循环程序，开始PCR反应。
Step | Temp. | Time |
Initial Denaturation | 95°C | 2~5min |
40~45 Cycles | Denaturation | 95°C | 15s |
Annealing/ Extension | 60°C | 15~30s |
Melt Curve | 60-95°C | N/A* |
#探针浓度与仪器、探针种类、标记物质有关。通常浓度宜低于引物浓度。
*按照仪器推荐设置溶解曲线条件。
常见问题
1. 严格设置阳性对照和阴性对照。
2. 引物设计
（1） 建议使用专业软件如Oligo或Primer，注意引物的GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题；
（2） 建议使用有文献报道过或者有数据库收录的引物序列；
（3） 引物退火温度<60℃时，建议使用三步法PCR扩增，即在两步法基础上增加72°C延伸30s循环。
3. 反应条件优化
（1） 引物浓度最好在0.2~0.5µM，可以在0.1~1µM范围内调整；
（2） 提高退火温度可以提高反应特异性，在引物Tm值较低时可以进行三步法扩增；
（3） 产物长度>350bp或者GC含量较高时，可以增减延伸时间至60s。
