Theta SYBR Green One-Step RT-qPCR Kit
-20℃避光储存，<0℃避光运输，避免反复冻融。
包装内容
产品编号 | 产品名称 | 包装 |
P300113-1 | SYBR Green One-Step Enzyme Mix (10X) | 200µl |
P300113-2 | SYBR Green One-Step Reaction Buffer (2X) | 1ml |
P300113-3 | Low ROX (50X) | 40µl |
P300113-4 | High ROX (50X) | 40µl |
P300113-5 | Nuclease-free Water | 1ml |
产品简介
实时荧光定量PCR (Quantitative PCR-QPCR或real-time PCR)高品质试剂盒，用于RNA的特异性超高灵敏度定量检测；
反转录和荧光定量PCR一步法反应；
使用SYBR Green I作为双链DNA产物染料；
提供了Low ROX和High ROX试剂，广泛兼容于常规荧光定量PCR仪。
预混液包含所有通用组分，用户只需自备引物、样品RNA即可。
使用说明
反应体系：解冻并彻底混匀各组分，于冰浴设置如下反应体系(以96孔板为例)。
Component | 20μl reaction | Final Concentration |
Theta Combo SYBR Green One-Step Reaction Buffer (2X) | 10μl | 1X |
Theta Combo SYBR Green One-Step Enzyme Mix (10X) | 2μl |
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5µM Forward Primer | 1μl | 0.25µM (0.1~1µM) |
5µM Reverse Primer | 1μl | 0.25µM (0.1~1µM) |
Template RNA | 2μl | 1pg-2µg |
ROX (50X) | 0/0.4μl | Low/high ROX |
Nuclease-free water | Up to 20µl |
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吹吸混匀后短暂离心，将PCR管或板置于荧光定量PCR仪；
设置如下热循环程序，开始PCR反应。
Step | Temp. | Time |
Reverse Transcription | 50°C | 15~30min |
Initial Denaturation | 95°C | 2~5min |
40~45 Cycles | Denaturation | 95°C | 15s |
Annealing/ Extension | 60°C | 15~30s |
Melt Curve | 60-95°C | N/A* |
反转录一般15分钟即可，如果片段较长，可延长至30分钟
预变性通常设置为95℃，2分钟；对于复杂或高GC模版可延长至5分钟；
对于大于350bp的扩增产物，可以适当增加延伸时间或采用三步法；
*按照仪器推荐设置溶解曲线条件。
常见问题
1. 严格设置阳性对照和阴性对照。
2. 引物设计
（1） 建议使用专业软件如Oligo或Primer，注意引物的GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题；
（2） 建议使用有文献报道过或者有数据库收录的引物序列；
（3） 引物退火温度<60℃时，建议使用三步法PCR扩增，即在两步法基础上增加72°C延伸30s循环。
3. 反应条件优化
（1） 反应前严格避免RNA降解；
（2） 引物浓度最好在0.2~0.5µM，可以在0.1~1µM范围内调整；
（3） 提高退火温度可以提高反应特异性，在引物Tm值较低时可以进行三步法扩增；
（4） 产物长度>350bp或者GC含量较高时，可以增减延伸时间至60s。
