Theta SYBR Green qPCR Mix (2X, Low Rox)
-20℃避光储存，<0℃避光运输，避免反复冻融。
包装内容
产品编号 | 产品名称 | 包装 |
P300111 | Theta SYBR Green qPCR Mix (2X, Low Rox) | 1/5/25ml |
产品简介
实时荧光定量PCR (Quantitative PCR-QPCR或real-time PCR)高品质预混液，用于cDNA和基因组DNA等的特异性高灵敏度定量检测；
使用SYBR Green I作为双链DNA产物染料；
使用耦合的Taq DNA聚合酶，实现便捷高效的热启动聚合反应；
含低浓度ROX，适用于需低浓度ROX作校正的荧光定量PCR仪：
ABI: 7500(Fast), ViiA 7, QuantStudio 6/7 Flex；
Stratagene: Mx3000P, Mx3005P, Mx4000；
Qiagen/Corbett Rotor-Gene: 3000；
Bio-Rad/MJ: Chromo4, Opticon /2。
预混液包含所有通用组分，用户只需自备引物、模板DNA和去离子水即可。
使用说明
反应体系：解冻并彻底混匀各组分，于冰浴设置如下反应体系(以96孔板为例)。
Component | 20μl reaction | Final Concentration |
Theta SYBR Green qPCR Mix (2X, Low Rox) | 10μl | 1X |
10µM Forward Primer | 1μl | 0.5µM (0.1~1µM) |
10µM Reverse Primer | 1μl | 0.5µM (0.1~1µM) |
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Template DNA | Xμl | Genomic DNA | 10–100ng |
cDNA | 1-10ng |
Nuclease-free water | Up to 20µl |
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短暂离心后，将PCR管或板置于荧光定量PCR仪；
设置如下热循环程序，开始PCR反应。
Step | Temp. | Time |
Initial Denaturation | 95°C | 2~5min |
40~45 Cycles | Denaturation | 95°C | 15s |
Annealing/ Extension | 60°C | 15~30s |
Melt Curve | 60-95°C | N/A* |
*按照仪器推荐设置溶解曲线条件。
常见问题
1. 严格设置阳性对照和阴性对照。
2. 引物设计
（1） 建议使用专业软件如Oligo或Primer，注意引物的GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题；
（2） 建议使用有文献报道过或者有数据库收录的引物序列；
（3） 引物退火温度<60℃时，建议使用三步法PCR扩增，即在两步法基础上增加72°C延伸30s循环。
3. 反应条件优化
（1） 引物浓度最好在0.2~0.5µM，可以在0.1~1µM范围内调整；
（2） 提高退火温度可以提高反应特异性，在引物Tm值较低时可以进行三步法扩增；
（3） 产物长度>350bp或者GC含量较高时，可以增减延伸时间至60s。
