Gibson无缝拼接预混液

-20℃储存，<0℃运输。

包装内容：

*Positive control含0.05pmol线性化的pUC19和0.1pmol卡那霉素抗性基因，拼接成功产物同时具备氨苄和卡那抗性。

产品简介：

单管等温反应，高保真一步DNA无缝拼接。

适用于单个或多个不同长度/末端的DNA片段插入拼接。

依赖于末端重叠区域（15~40bp，Tm≥48°C，假设A-T配对=2°C，G-C配对=4°C）拼接。

总体反应时间小于30分钟，产物可以直接转化感受态细胞。

使用说明：

1.        制备线性化载体

确定线性化位点，可以使用酶切或者PCR扩增方法制备。

如必要，PCR质粒模板通过DpnI消化去除。

产物可以通过琼脂糖电泳进行分析或纯化。

线性化载体末端结构不影响后续拼接反应。

2.        制备插入片段

插入片段可以通过PCR扩增。

PCR引物应包括拼接位点重叠序列部分（15~40bp）和插入片段特异序列部分。保持拼接位点重叠序列部分Tm值（A-T= 2°C，G-C = 4°C）≥48℃。插入片段特异序列部分按常规PCR设计引物。

PCR产物可以通过琼脂糖电泳进行分析或纯化。质粒模板可通过DnpI消化去除。

3.        设置拼接反应

解冻并彻底混匀各组分，于冰上设置如下反应体系。

50℃孵育15分钟，对于多片段拼接可延长至1小时。

拼接产物可短暂冰浴后直接转化感受态细胞，也可置于-20℃保存。

对于2~3片段拼接，推荐载体：插入片段比为1：2-3，总摩尔数为0.02-0.5pmol；

多片段拼接推荐载体：插入片段比为1:1，总摩尔数为0.2-1pmol;

短插入片段<200bp拼接推荐载体：插入片段比<1:5；

多片段拼接建议末端重叠区域长20-30bp。

纯化DNA片段可显著提高拼接和转化效率。